FactorsaffectingAgrobacterium-mediatedtransformationinHybanthusenneaspermus(L.)F.Muell.
发表期刊:PlantBiotechnologyReports
发表时间：-05-25发表单位：韩国大田中山大学农业与生命科学学院园艺系分子遗传与基因组学实验室
IF2.Q4
摘要
以带有携带nptII和gusA基因的pCAMBIA的菌株LBA为外植体，建立了根癌农杆菌介导的鼠鞭草遗传转化体系。为了筛选转基因植物，叶片外植体对卡那霉素的敏感性被标准化(mg/l)。转化参数(OD、毒力诱导剂、感染时间、共培养周期、杀菌抗生素等。)在本研究中评估了影响基因转移和整合的因素。用农杆菌菌株LBA处理14天的预培养外植体。优化的参数如培养密度为0.5OD，感染时间为6分钟，AS浓度为lM，共培养3天显示出基于GUS表达分析的最大转化效率。通过聚合酶链反应和Southern印迹分析证实了转基因中gusA的存在。本转化实验产生了20个具有较高转化效率(28%)的芽/外植体。该方案可用于引入用于性状改良的基因以及用于改变次级代谢产物产生的代谢途径。前言
hybanthusennestermus(鼠鞭草)，被认为是传统的药用植物之一。这种植物有许多有用的主要次生代谢物，如β-谷甾醇、异丙肾上腺素、一种肽类生物碱、“橙*酰胺”和类*酮。它还含有称为“环肽”的植物防御肽的主要来源。已知这种植物的药物可以治疗淋病、泌尿系统感染、尿道问题、血液紊乱、哮喘、癫痫、炎症、关节炎和糖尿病。该药物具有镇痛、镇咳、抗惊厥和保肝作用。因此，这种有价值的药用植物被认为是合成各种药物的重要资源。
植物介导的基因转移是分析基因功能及其表达的有效技术。它有助于理解植物次级代谢途径的详细方向。规范药用植物转化方法是探索次生产物分子生物合成的基础工作。目前，许多生物技术方法已经被用于增加药用植物中的次生代谢物。植物生物合成途径的遗传改良导致了次生代谢物的增加。转基因系统的开发对于珍贵药用植物的基因组升级至关重要，这些药用植物是药物动力学次生代谢物的丰富资源。
迄今为止，还没有关于根癌农杆菌介导的植物转化的报道。在许多植物中，转基因植物的恢复是复杂的，因为转化的植物细胞由于各种不适合植物再生的因素而没有再生。我们已经通过适合农杆菌转化的鼠鞭草外植体建立了一个体外再生系统(未公开的数据)。在本研究中，通过包括各种参数如OD、毒力诱导剂、感染策略、共培养周期、杀菌抗生素等，已经进行了全面的努力来标准化农杆菌介导的遗传转化。
结果
利用叶片外植体为鼠鞭草建立了一个转化研究。在我们之前的实验中，叶外植体被认为是鼠鞭草芽再生的合适外植体来源(未公开的数据)。在本研究中，通过研究与LBA共培养的鼠鞭草叶片外植体后gusA基因的表达来评估影响基因传递的各种参数(选择剂的类型及其浓度、农杆菌菌株、培养物OD、AS浓度、感染时间、共培养持续时间)。通过GUS分析和分子分析检测gusA基因的瞬时和稳定活性，解决了转移和整合问题。
1、头孢噻肟和特美汀对叶片再生的影响
表1显示了不同浓度的头孢噻肟和特美汀在6周后控制农杆菌过度生长而不抑制叶片外植体芽再生的结果。在含有头孢噻肟或特美汀的培养基(芽诱导)上培养的叶片外植体的反应明显低于在无抗生素的芽诱导培养基(对照)上培养的外植体。在本研究中，叶片外植体在添加特美汀的培养基上再生的芽数高于添加头孢噻肟的培养基(表1)。这可能是由于再生培养基中外源添加的抗生素剂量可能引起病原体攻击，并在细胞死亡和芽生成能力降低后引起防御反应、超甲基化。在毫克/升头孢噻肟或毫克/升特美汀的水平下，叶片外植体表现出57%或82%的芽诱导反应，产生24个芽/外植体或35个芽/外植体。将头孢噻肟的浓度提高到毫克/升，将特美汀的浓度提高到毫克/升，显著降低了响应频率[分别为33和70%]，以及每个外植体的芽数[分别为14和30个芽](表1)。从目前的研究来看，与头孢噻肟处理相比，mg/l的特美汀有效地消除了细菌生长，而不影响叶片再生的形态发生。除此之外，与含有头孢噻肟的培养基相比，再生芽在含有特美汀的培养基中生长更绿、更健康和更活跃。特美汀在控制农杆菌生长方面显示出积极作用。目前的研究证实了这些早期关于使用特美汀消除细菌并随后用于芽再生的报道。
2、叶片外植体对卡那霉素的敏感性
有效的选择方法对于通过农杆菌介导的转化正向产生转化植物至关重要。选择剂应该具有阻止未转化细胞/组织进一步发育的能力。卡那霉素是选择转基因植物的常用抗生素。在目前的实验中，我们注意到叶片外植体对卡那霉素的反应非常敏感，再生能力受卡那霉素浓度的影响。从叶片外植体产生的多芽数量的轻微减少与卡那霉素浓度的增加有关，反之亦然。在不含卡那霉素的芽诱导培养基中培养的叶片外植体显示出94%的再生反应，每外植体产生40个芽。75毫克/升卡那霉素显著影响多芽再生(27%的反应和11个芽/外植体)，毫克/升或更高时再生完全受阻(表2)。
在农杆菌介导的转化中，卡那霉素以20mg/l的浓度筛选转基因植株。Yevtushenko和Misra(2)注意到，mg/l卡那霉素对杂种植株黑杨9号杨的枝条再生具有致死和抑制作用。类似地，发现毫克/升卡那霉素可有效消除未转化的*瓜和颠茄芽。在另一项研究中，在卡那霉素培养基上培养的伸长枝对根诱导培养基没有反应并导致枝坏死，而对照培养基(不含卡那霉素)在1周内对从伸长枝开始的根有反应。然而，在4周后，在75毫克/升或更高的卡那霉素浓度下没有观察到根诱导(表3)。因此，卡那霉素水平(和75毫克/升)被优化为分别对鼠鞭草的叶片外植体和伸长的芽的最小抑制浓度，并且这些浓度被用于选择转化的芽和根。3、鼠鞭草的转化
3.1预培养时间对转化效率的影响
通过在MS培养基上添加BA（4mg/l）、NAA（1.5mg/l）和亚精胺（20mg/l）培养不同时间（0、7、14、21和28天），研究了预培养时间对转化效率的影响。外植体的预培养是基因转移研究和转基因植株再生的关键。采用生物状态良好的外植体可以提高T-DNA插入植物细胞的效率，促进转基因的形成.转化效率随着预培养时间的延长而下降。预培养14天的叶片外植体表现出最大GUS表达频率(24%)(表4；图1)。统计分析表明转化效率和预培养时间是相互关联的。由于叶片外植体在农杆菌感染下的存活能力较弱，因此短时间预培养或不预培养的叶片外植体的转化效率较低。此外，延长预培养时间导致GUS表达效率低。这可能是由于外植体成熟组织减少了农杆菌感染和T-DNA整合。3.2光密度对转换效率的影响
当叶片以0.5od的密度感染农杆菌细胞时，获得最大转化效率(24%)(表4；图1)。Gu等人(8)报道了在转化实验中较高密度的农杆菌积累毒素到受体细胞。在植物转化方法中，几个结果表明农杆菌感染的最佳细胞密度在0.1和1OD之间。它可能因植物种类、外植体、菌株、共培养持续时间、培养基、酸碱度、光照、温度等而异。外植体的再生能力和转化效率降低是由于农杆菌培养物过度生长导致致死化合物积累增加，从而导致组织坏死。3.3感染时间对转化效率的影响
T-DNA的重新定位和掺入取决于土壤杆菌培养物的吸光度，这将有助于细菌细胞与所用的外植体附着。在0.5OD的农杆菌悬浮液中培养6分钟的预培养叶导致转化效率(25%)与感染2分钟和4分钟的叶平行，而在农杆菌中培养8分钟以上导致转基因效率下降(表4；图1)。由于农杆菌的过度生长，延长感染时间会影响外植体的再生能力。类似地，一些作者报道了不同的感染时间(2-60分钟)，因为感染时间取决于外植体的性质和年龄、农杆菌菌株、培养基的类型和组成、感染方式和温度。
3.4共培养对转化效率的影响
共培养持续时间因外植体类型、植物基因型、农杆菌菌株和病毒基因诱导剂而异(Rajesh等人，年)。转化效率随着共培养天数的增加而增加，共培养3天的外植体转化效率达到最大值(27%)(表4；图1)。延长的培养期在叶片介导的转化中显示出阴性结果。在较早的一份关于鬼臼毒素转化的报告中，3天的共培养有利于获得最高的转化效率。
3.5乙酰丁香酮对转化效率的影响
乙酰丁香酮是一种病毒基因诱导剂，它参与了T-DNA向植物细胞的迁移。在感染农业培养物的叶片外植体中获得最高的转化效率(29%)，并且在具有lMAS的MS培养基上生长。已经观察到，将共培养培养基中as的浓度从50提高到lM显著提高了叶片外植体的转化效率。同样，在感染和共培养培养基中补充砷(lM)有利于农杆菌感染，并提高了Sesbaniadrummondii的转化效率。本结果证实了培养基中添加砷改善了来自叶片外植体的转化体。类似的结果也在珊瑚藻转化中获得。Declercq等人(2)认为，较低浓度的砷(低于lM)不会增强毒力，而较高浓度的砷(高于lM)会对农杆菌细胞和外植体产生毒性。此外，鼠鞭草转化的砷水平的差异可能是由于共培养持续时间和外植体能力的差异。在本研究中，共培养培养基中lM的砷被证明是诱导农杆菌毒力系统的有效苯酚补充剂。
3.6GUS表达分析
在叶外植体近端和远端发现的GUS表达的蓝色染色(图1a，b)表明农杆菌感染的叶外植体两端都有活跃出现的分生组织细胞，它们是农杆菌附着和T-DNA递送的靶区。GUS表达分析表明，gusA在外植体、多芽、伸长芽和完整植株的X-Gluc染色中以相同深蓝颜色的形式表达(图1，2)。来自外植体的未转化(对照)的多个芽、伸长的芽和完整的植株(图2b，d，f)在X-Gluc染色时不能表达蓝色。3.7转基因植物再生
用卡那霉素培养基的转化方法(包括14天预培养，6分钟感染，3天共培养，0.5OD)用于从叶片外植体再生转化的植物(表4)。用农杆菌培养物感染的叶片外植体在选择培养基上再生为芽；然而，未转化的分生组织细胞不能从外植体进一步再生并死亡。在选择压力下，从叶片外植体远端再生的一些芽没有显示GUS表达的蓝色(图1j，k)。在我们的研究中，芽形成于选择培养基中叶片的两个切割端(图3a-g)。从外植体中除去这些芽，并转移到新的卡那霉素培养基中(图3h)。
在该培养基中，6周后共获得20.4个转基因芽(表5)。在相同的卡那霉素培养基中，外植体中增殖的芽伸长并达到4-5厘米。将这些转基因芽转移到含有卡那霉素75、1.5毫克/升吲哚丁酸和20毫克/升腐胺的生根培养基中5周。再生反应和转基因芽产生数量相对低于正常再生方案。在转化条件下，将叶片外植体暴露于农杆菌感染、抑菌剂和抗生素。这可能是再生反应和芽数减少的原因。在本研究中，与转基因芽形成类似，根诱导反应和根诱导反应的数量也相对低于正常生根反应。将转化的芽进行硬化处理，结果表明转化效率为28.8%(表5)。
3.8聚合酶链反应和Southern印迹分析用gusA引物对抗卡那霉素GUS阳性的植物及其对照进行PCR扩增。用gusA引物扩增的转基因植株在预期范围（bp）显示出DNA条带（图4a）。这些扩增证实了转基因植株中存在转移基因片段。对照组在PCR扩增中未检测到本研究所用的基因片段。为了证实gusA拷贝数和在鼠鞭草中的掺入，在从转基因和对照植物获得的叶DNA中进行DNA印迹(图4b)。DNA和pCAMBIA用EcoRI消化，它在T-DNA中确定了一个不同的位置。因为pCAMBIA的T-DNA有一个单一的EcoRI位点，用EcoRI消化基因组DNA并用gusA的扩增产物进行探测为每个连接的拷贝创造了一个专有部分。因此，预期条带的数量和位置将模仿gusA在不同位置的结合，并提供转化植物中拷贝数总和的评估。每个条带的位置因植株而异，从而说明了游离转化过程和不加选择的合并。转化的鼠鞭草试管苗显示整合到基因组中的gusA的单拷贝或多拷贝(图4b)。
结论
这里提出的方案通过优化的农杆菌介导的转化致使转基因鼠鞭草植物的有效培育。用0.5OD根癌农杆菌LBA感染14日龄预培养叶片6分钟，在lMAS存在下共培养3天，获得20个芽/外植体，最高转化效率为28.8%。在所测试的各种因素中，培养密度、砷浓度和感染时间是为鼠鞭草提供有效转基因系统的重要参数。本研究建立的遗传转化方法可用于鼠鞭草的代谢途径，以提高有价值的次生代谢产物。
感悟
通过阅读翻译这篇文献，我学习到影响农杆菌介导的鼠鞭草遗传转化的主要因素有预培养时间、光密度、感染时间、共培养周期、乙酰丁香酮等，要想培育优良的转基因植物都需要一个优良的转化方案，把控好一些指标，这篇文献为今后自己的实验思路提供一个良好的参考。
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